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研究背景

乙肝病毒（HBV）是迄今所有已知可感染人體並具有獨立複製能力的雙鏈DNA病毒中最小且最有效的病毒，僅含3.2 kb ，屬於嗜肝DNA病毒科。HBV可以引發急性和慢性肝炎，後者又可發展為肝硬化乃至肝癌。HBV感染呈全球性，全球約20億人曾感染過HBV ，其中3.5多億人為慢性HBV感染患者，每年約有786000人死於HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發性肝細胞癌（HCC）。美國食品藥品監督管理局已批準兩個Ⅰ型幹擾素和5個核苷逆轉錄酶抑製劑用於乙肝的治療，但臨床效果仍然十分有限。雖然預防乙型肝炎的疫苗在很大程度上減少了慢性乙肝的發生，但疫苗接種覆蓋率存在巨大的地域差異性，美國高達90% ，而南亞僅占56% 。防治指南先後強調了抗病毒是治療乙肝的重中之重，因而詳細闡明HBV的複製機製，並以此為基礎，尋找高效低毒的抗病毒作用靶點已成為防治工作者的研究重心，並可為新藥研究發現奠定堅實的前期基礎。

HBV一旦進入人體，病毒包膜表麵上抗原大蛋白（LHBs）N端27~46位氨基酸就與肝細胞膜上的鈉離子-牛磺膽酸協同轉運蛋白（NTPC）結合，病毒顆粒通過受體介導的細胞內吞作用進入細胞，再由細胞微管係統轉運至核孔複合物。HBV病毒是240個由兩個核心蛋白（core protein ，CP）以一定的夾角形成的二聚體亞單位，以一定的空間順序結合形成的對稱的20麵體。病毒的CP經未知磷酸化機製暴露核內定位信號，與核孔複合物結合而脫去衣殼，HBV DNA進入核內，病毒顆粒由內吞到入核這一過程需要細胞內GTP激酶信號通路的參與。HBV DNA再經目前機製未明的修複正鏈缺口轉變成超共價閉合環狀DNA（cccDNA）。有研究在穩定轉染HBV DNA和DHBV DNA的細胞株中分離到去蛋白rcDNA（protein free-rcDNA,PF-RC），並證明PF-RC是rcDNA到cccDNA轉變過程的中間體，可能是在胞質核衣殼內，通過某種具有絲氨酸蛋白酶活性的物質切斷P蛋白酪氨酸殘基與負鏈5' 端磷酸基團間的磷酸二酯鍵形成的，rcDNA去蛋白化激發部分核衣殼解聚，暴露核定位信號，通過核孔複合體介導PF-RC轉運到核內，然後由宿主細胞相關酶把PF-RC轉化成cccDNA 。用siRNA抑製核轉運蛋白β1表達或表達功能缺陷的轉運蛋白β1 ，均導致胞質PF-RC積聚，而胞核內PF-RC及cccDNA減少。細胞RNA多聚酶Ⅱ以cccDNA為模板，轉錄產生mRNA 。病毒DNA聚合酶（即P蛋白）結合於pgRNA（前基因組RNA ，也是3.5kb mRNA）5' 端的莖環結構，促使pgRNA包裹入核心顆粒中，P蛋白TP區第63位酪氨酸殘基上的羥基與GTP共價結合引發合成5'-GAAT-3' 的四聚DNA引物，P蛋白與該引物轉位到pgRNA3' 端DR1區，以pgRNA為模板轉錄合成互補性負鏈DNA ，同時DNA聚合酶的RNAse H（核糖核酸酶H）切割模板pgRNA ，僅保留5' 端完整的DR1片段，與該片段互補的短小RNA脫離並附著在負鏈5' 端，引導正鏈合成。當合成延伸到負鏈5' 端時，DNA聚合酶模板切換至負鏈3' 端繼續合成正鏈DNA ，形成鬆弛環狀DNA（rcDNA），再移去共價結合在負鏈5' 端的病毒聚合酶和正鏈5' 端的短鏈RNA低聚物（用於啟動），就形成了cccDNA 。正鏈合成啟動時，核心顆粒結構改變，成為成熟的核心顆粒，可與表麵抗原相互識別，以芽生的方式形成完整病毒顆粒。包裹著衣殼的HBV-DNA再由膜包裹後分泌到細胞外，也可以重新脫去衣殼進入細胞核內，以維持細胞核內cccDNA的數量。如下圖所示。

就理論而言，病毒複製的各個階段都有可能成為藥物靶點。故針對病毒的吸附、穿入、脫殼、生物合成及裝配分泌各階段特點，選擇相應的有效藥物去阻斷其生命周期，從而實現抑製乙肝病毒繁殖、擴散。鑒於HBV為迄今已知所有可感染人體並具有獨立複製能力的雙鏈DNA病毒中最小且最有效的病毒，人類經過長期的奮鬥，人們逐漸開拓治療的新方略，其中包括：（1）用小分子作用於病毒的變構效應以實現衣殼蛋白、糖蛋白錯配不失為抗病毒良策之一，而且在已發表的HBV的文章得到佐證。（2）在HBV組裝時，分為兩個不同領域應對，把自組裝和組裝調控分開，各個擊破。調控是在變構水平上進行，即調控分子構象的變化，細胞周期一般是蛋白改變其活動，這些蛋白是由效應分子誘導的；調控過程還需要病毒和宿主因子參與。阻隔調控是一個理想的抗病毒治療的目標，而目前直接實現對病毒組裝物理化學性質的調控仍處於初始探索階段。（3）成核過程是成核單元先形成成核核心，在足夠成核單元存在下裝配成功；如果成核單元形成成核核心的過程過快，導致餘下的成核單元裝配不順利；也有可能在成核過程中，成核單元結合不牢固。（4）研究發現，陽離子細胞穿透肽（CPP）及其脂肪共軛域（CatLip）可以攜帶不帶電荷的生物活性分子進入細胞內。使用感染和轉染實驗，發現CatLip肽能引起包膜蛋白的積累，導致PreS/S結構域發生嚴重變化，從而抑製鴨乙型肝炎病毒複製，變性的CPP也為抗病毒治療提供了新靶點。

研究模型

南宮娛樂建立了HBV體外轉染模型：以腺病毒為載體，將1.3倍的HBV轉入包裝細胞293內，再用包裝好的重組病毒（AdHBV1.3）感染HepG2細胞；不僅可以產生高水平的HBV複製，而且可以通過整合在腺病毒骨架質粒上綠色熒光蛋白基因的表達直接觀察轉染和感染效率。如下圖所示。

研究案例

目的：研究雙鏈DNA對HBV複製的影響及其胞內信號傳導
結論：ds-DNA能夠刺激肝癌細胞產生I型幹擾素應答，同時伴隨IRF3與NF-kB的活化；ds-DNA能夠促進HBV的複製
路線：

1.poly(dA-dT).poly(dT-dA)轉染HepG2與HepG2.2.15細胞，qPCR檢測I型幹擾素IFN-beta、幹擾素應答基因IFIT1與炎症因子TNF-alpha的表達，WB檢測NF-kB 、IRF3 、TBK1以及磷酸化的TBK1的表達。

2.HBV1.3複製型質粒轉染HepG2細胞，HBV siRNA轉染HepG2.2.15 ，qPCR檢測細胞中IFIT1的表達。

3.poly(dA-dT).poly(dT-dA)轉染HepG2.2.15細胞，southern blot檢測細胞內HBV的複製中間體，qPCR檢測細胞上清中HBV顆粒，CMIA檢測HBV s抗原與e抗原的表達。利用抑製劑阻斷NF-kB 、IRF3以及MAPK激酶信號通路，southern blot觀察poly(dA-dT).poly(dT-dA)對肝細胞內HBV複製中間體的影響。WB檢測細胞內ERK1/2的磷酸化。

核心文獻

1.Hepatitis B virus infection[J]. Lancet, 2014, pii:S0140-6736(14)60220-8. https://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(14)60220-8/abstract

2.Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 2016 Mar 17;531(7594):386-9. https://www.nature.com/nature/journal/v531/n7594/full/nature17170.html

3.New therapeutic agents for chronic hepatitis B. Lancet Infect Dis. 2016 Jan 12;S1473-3099(15)00436-3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26795693

4.HBV-specific and global T-cell dysfunction in chronic hepatitis B. Gastroenterology. 2015 Dec 9;S0016-5085(15)01736-9. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0016-5085(15)01736-9

5.Infection and Cancer: The Case of Hepatitis B. J Clin Oncol. 2016 Jan 1;34(1):83-90. https://jco.ascopubs.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=26578611