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    研究背景
    間充質幹細胞是幹細胞家族的又一重要成員 ,源於發育早期的中胚層和外胚層 。間充質幹細胞是一種具有自我複製能力和多向分化潛能的成體幹細胞 ,屬於非終末分化細胞 ,它既有間質細胞 ,又有內皮細胞及上皮細胞的特征 。間充質幹細胞在體外特定的誘導條件下 ,可分化為脂肪 、軟骨 、骨 、肌肉 、肌腱 、神經 、肝 、心肌 、胰島β細胞和內皮等多種組織細胞 ,連續傳代培養和冷凍保存後仍具有多向分化潛能 。不論是自體還是同種異源的間充質幹細胞 ,一般都不會引起宿主的免疫反應 。

    典型的人間充質幹細胞一般具有如下生物學特性 :細胞為成纖維細胞樣 ,呈漩渦狀貼壁生長 ,體外擴增至12代 ,細胞形態不發生明顯改變 ,高表達間質細胞標記CD73(SH3 ,4) 、CD105(SH2) 、CD166 ,不表達造血細胞標記CD34 、CD45 。在適宜的誘導條件下 ,間充質幹細胞能夠較為容易地分化為軟骨 、成骨和脂肪細胞 ,如下圖所示 。目前 ,根據間充質幹細胞的生物學特性 ,已建立骨髓 、脂肪 、臍血 、臍帶等多種組織來源間充質幹細胞的分離、培養 、擴增和鑒定的實驗方法 。間充質幹細胞最早在骨髓中發現 ,隨後還發現存在於人體發生 、發育過程的許多種組織中 。目前 ,南宮娛樂能夠從骨髓 、脂肪 、滑膜 、骨骼 、肌肉 、肺 、肝 、胰腺等組織以及羊水 、臍帶血中分離和製備間充質幹細胞 ,用得最多的是骨髓來源的間充質幹細胞 。

    鑒於間充質幹細胞具有多向分化潛能 、能支持造血和促進造血幹細胞植入 、調節免疫以及分離培養操作簡便等特點 ,正日益受到人們的關注 。隨著間充質幹細胞及其相關技術的日益成熟 ,臨床研究已經在許多國家開展 。作為種子細胞 ,臨床上主要用於治療機體無法自然修複的組織細胞和器官損傷的多種難治性疾病 ;作為免疫調節細胞 ,治療免疫排斥和自身免疫性疾病 。

    最初的臨床研究是1995年由Lazarus等人進行的 ,他們收集緩解期血液腫瘤患者的自體MSC ,在體外擴增培養4~7周 ,然後再靜脈注射入患者體內 ,患者被分為3組 ,分別給予不同劑量的MSC ,注射後沒有觀察到毒副作用 ,提示MSC用於移植治療安全可靠 。隨後自體MSC的臨床報道逐漸增多 ,病種涉及放療及化療後造血重建 、移植物抗宿主病(GVHD) 、心髒係統疾病等 ,在這些報道中均證明臨床經靜脈輸注安全可靠 。 然而自體間充質幹細胞的應用過程中逐漸暴露了不便之處 :例如擴增能力個體差異很大 ;潛在的腫瘤細胞汙染風險 ;培養需要一定的時間 ,不能及時適應病情的需要等 。這些製約了自體間充質幹細胞的使用 。2004年 ,Le Blanc等報道了首例半相合異基因間充質幹細胞移植治療GVHD獲得成功 ,其後又報道了異基因配型不合的間充質幹細胞移植治療GVHD的有效性 ,並且認為在應用間充質幹細胞治療GVHD不需要嚴格的配型 ,其後又有多篇異基因未經配型的MSC治療GVHD 、促進造血重建的報道 ,其MSC來源涉及骨髓 、脂肪 、牙周等 。

    美國FDA已批準了近60項臨床試驗 ,主要包括以下幾個方麵 :(1)造血幹細胞移植 :增強造血功能 ;促使造血幹細胞移植物的植入 ;治療移植物抗宿主病 。(2)組織損傷的修複 :骨 、軟骨 、關節損傷 、心髒損傷 ;肝髒損傷 ;脊髓損傷和神經係統疾病 。(3)自身免疫病 :係統性紅斑狼瘡 、硬皮病 、類風濕關節炎 、血管炎 、強直性脊柱炎 、幹燥綜合征 、白塞病 、多肌炎/皮肌炎 、原發性膽汁性肝硬化和炎性腸炎等 。(4)作為基因治療的載體 。其中移植物抗宿主病 、克隆氏病的治療在美國已經進入到三期臨床階段 。我國已開始用間充質幹細胞治療臨床上一些難治性疾病 ,如係統性紅斑狼瘡 、係統性硬化症 、類風濕關節炎 、糖尿病 、糖尿病足 、肝硬化等 ,根據初步的臨床報告 ,間充質幹細胞對這些疾病的治療都取得很明顯療效 ,部分患者擺脫了長期使用藥物的困擾 。

    研究模型

    南宮娛樂已經掌握了間充質幹細胞的原代分離培養:取大鼠兩側股骨和脛骨 ,剪去幹骺端 ,用低糖DMEM從骨髓腔中衝出骨髓並打散 。直接將細胞懸液接種於培養瓶中 。原代取材培養後24h即有細胞貼壁 。傳代後細胞呈多角型貼壁均勻生長 ,如下圖所示 。

    南宮娛樂建立了間充質幹細胞的成脂和成骨誘導分化模型 ,分別進行了鑒定 ,如下圖所示 。

    研究案例
    目的 :探討Wnt通路對於體外培養的大鼠骨髓MSC向肌細胞特異性分化 、增殖和遷移的影響
    結論 :激活經典Wnt通路 ,能夠激活成肌相關基因的表達 ,誘導大鼠骨髓間充質幹細胞向成肌方向分化 ;能夠抑製成脂相關基因的表達 ,抑製大鼠間充質幹細胞向成脂方向分化
    路線 :
    • 1) pGKWnt3a轉染小鼠胸腺激酶缺陷細胞(L-M TK)鑒定及條件培養基製備
    • 2) Wnt3a對大鼠MSC增殖的影響分析 :經Wnt3a-CM培養 ,能夠激活大鼠MSC的經典Wnt信號通路 ;Wnt在體外能夠特異性促進大鼠MSC的增殖
    • 3) Wnt3a對大鼠MSC向成肌分化的影響 :應用Wnt3a-CM誘導MSC向成肌分化10天,可見有肌管形成 。在Wnt3a-CM培養2d ,可見有Pax7表達 ;在培養後4d ,MyoD和Myf5開始表達 。
    • 4) Wnt3a對大鼠MSC向成脂方向分化的影響 :Wnt3a-CM顯著抑製MSC向成脂方向分化 ;能夠分別抑製C/EBP-a和PPAR-y的表達 。
    • 5) 在體外Wnt3a能夠促進MSC遷移
    核心文獻
    • 1) MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus. Cell Metab. 2015 Sep 9;S1550-4131. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1550-4131(15)00409-X
    • 2) Allogeneic Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Promote Healing of Refractory Perianal Fistulas in Patients With Crohn's Disease. Gastroenterology. 2015 Oct;149(4):918-27.e6. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0016-5085(15)00873-2
    • 3) Bone marrow-derived mesenchymal stromal cell treatment in patients with severe ischaemic heart failure: a randomized placebo-controlled trial (MSC-HF trial). Eur Heart J. 2015 Apr 29;ehv136. 10.1093. https://eurheartj.oxfordjournals.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=25926562
    • 4) Vascularized and Complex Organ Buds from Diverse Tissues via Mesenchymal Cell-Driven Condensation. Cell Stem Cell. 2015 May 7;16(5):556-65. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1934-5909(15)00115-0
    • 5) The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nat Cell Biol. 2015 Apr;17(4):386-96. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmid/25799059/

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