研究背景
脊髓損傷(SCI)多發生於30歲以下人群
,其發病率在我國呈明顯上升趨勢
。SCI後患者勞動力不同程度地喪失對家庭及社會均帶來極大負擔
,因此促進SCI後功能修複重建具有重要意義
。影響SCI後軸突再生的因素主要包括兩方麵
,即損傷軸突周圍存在不利於細胞生長的內環境及成熟神經元內再生能力減弱
,其中膠質瘢痕的形成及其含有多種抑製成分
,是影響軸突再生的重要外部閃素
。形成膠質瘢痕的細胞成分包括星形膠質細胞
、少突膠質細胞
、少突膠質細胞前體細胞
、小膠質細胞等
,其中最主要的是星形膠質細胞成分
,其生物學特性在中樞神經損傷後發生一係列變化
,被稱為活化的星形膠質細胞
。多年來許多研究探討SCI後促進星形膠質細胞活化的多種分子機製
,並嚐試從信號通路
、細胞周期等不同角度對其進行調控
,在SCI修複方麵取得了令人鼓舞的成果
。
星形膠質細胞(astrocytes
,AST)是腦中主要的支持細胞
,在中樞神經係統(central nervous
system
,CNS)中AST最豐富
,其數量超出了神經元數量的5倍
。然而南宮娛樂對AST的了解遠遠落後於對神經元形態和功能的認識,原因可能是人們傳統上認為AST隻是簡單地填充在神經元與神經元的空隙之間以及AST並不產生動作電位
。AST支持著神經元的功能活動
,包括促進突觸形成
、調節細胞外的離子濃度和神經遞質
、為神經元提供代謝底物
、維持血腦屏障
、攝入穀氨酸抑製興奮性中毒
、清除自由基
、提供營養和生長因子
。在CNS受損後AST被激活
,形成反應性星形膠質細胞(reactive
astrocytes,RAS),如下圖所示
。已證實RAS會恢複成一種部分不成熟的分子狀態
,允許RAS再表達一係列因子/蛋白質修複受損部位的組織
。RAS可表達膠質纖維酸性蛋白(glial
fibrillary acidic
protein,GFAP)
、波形蛋白(vimentin)
、S100β
、巢蛋白(nestin)
、穀氨酸/天冬氨酸轉運體(glutamate-aspartate
transporter)和膠質細胞穀氨酸轉運體-1(glial glutamate
transporter-1)等
,而表達GFAP是RAS的典型特征
。在形態上的變化主要是AST胞體進行性肥大
,細胞質變得豐富
,可出現極化
。同時RAS突起的平均體積
,直徑及分支程度均會有所增加
。
反應性星形膠質細胞對軸突再生有著雙重影響
。一方麵,反應性星形膠質細胞能分泌神經營養因子,具有神經保護和修複作用
;另一方麵,反應性星形膠質細胞若過度增殖形成膠質瘢痕,則抑製軸突再生,不利於神經功能恢複
。AST是一類異質性
,可塑性很強的細胞
。CNS受損後
,AST受到環境影響通過增殖
,遷移至病變區域形成RAS
,形成物理和化學屏障阻礙軸突再生
。由於這些原因
,AST一直被許多研究人員列為目標細胞
,減少它們在受損區域的存在
。然而RAS可執行許多內源性修複
,且已證明消融AST後對恢複是有害的
。同時許多神經係統疾病有著共同的病理機製如氧化應激
、興奮性中毒和代謝障礙等
,均與調節AST功能相關
。因此南宮娛樂有必要發展更好的分子工具來指導和控製RAS的狀態
,以便當神經元處於不利條件時能將RAS轉換成支持細胞保護神經元
,維持神經功能的完整性
。
研究模型
南宮娛樂已經掌握了星形膠質細胞的原代分離培養
:在冰上迅速取出新生1-2d的SD大鼠的大腦
,用D-Hank液清洗並剔除腦膜和血管
,取出大腦皮質
,粉碎成1mm3左右的組織塊
,加入0.25%胰酶
,37度消化10min
。終止消化後
,100目篩網機械過濾
,1000rpm離心7min
。將沉澱的細胞加入含10%FBS的DMEM/F12完全培養液後
,吹打成單細胞懸液
。計數後按1E5/cm2的密度接種於T25中
。待培養的細胞70%融合時
,將培養瓶置於恒溫旋轉搖床上旋轉24h後
,棄去懸浮細胞及培養液
。星形膠質細胞的培養圖片如下所示
。
南宮娛樂建立了LPS刺激星形膠質細胞活化的模型
:在培養的星形膠質細胞中加入適量LPS
,培養一段時間後
,采用免疫熒光法檢測活化標誌GFAP的表達。如下圖所示
,LPS刺激後胞漿中GFAP熒光明顯增強
,細胞胞體肥大
,突起粗壯
。
研究案例
目的
:闡明TRPC3在星形膠質細胞活化中的作用
結論
:推測致炎因子引起星形膠質細胞活化的機製可能與TRPC3表達上調
、鈣離子內流增加有關
路線
:
-
觀察LPS對星形膠質細胞的功能影響
:LPS可引起星形膠質細胞活化
,表現為星形膠質細胞增殖
、GFAP表達上調及IL-6的分泌增加
-
觀察LPS對星形膠質細胞TRPC3的影響
:LPS誘導胞漿和核內TRPC3表達增強關
-
驗證TRPC3是否參與LPS誘導的星形膠質細胞活化反應
:利用2-APB和SKF96365兩種TRPC通道阻斷劑來觀察LPS對星形膠質細胞增殖
、GFAP表達和IL-6分泌的影響道有
-
LPS誘導的胞外鈣內流可能與TRPC通
核心文獻
-
Glia as drivers of abnormal neuronal activity. Nat Neurosci. 2015 Dec
29;19(1):28-33. https://dx.doi.org/10.1038/nn.4184
-
Adult Neural Stem Cells from the Subventricular Zone Give Rise to Reactive
Astrocytes in the Cortex after Stroke. Cell Stem Cell. 2015 Oct
6;S1934-5909(15)00357-4.
https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1934-5909(15)00357-4
-
STAT3-dependent reactive astrogliosesis in the spinal dorsal horn underlies
chronic itch. Nat Med. 2015 Aug;21(8):927-31. https://dx.doi.org/10.1038/nm.3912
-
Astrocyte Reactivity and Reactive Astrogliosesis: Costs and Benefits. Physiol
Rev. 2014 Oct;94(4):1077-1098.
https://physrev.physiology.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=25287860
-
GABA from reactive astrocytes impairs memory in mouse models of Alzheimer's
disease. Nat Med. 2014 Aug;20(8):886-96.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24973918