研究背景 支氣管哮喘（簡稱 ：哮喘）是一種常見病 、多發病 。目前 ，全球哮喘患者約3億人 ，中國哮喘患者約3000萬 。哮喘是影響人們身心健康的重要疾病 。治療不及時 、不規範 ，哮喘可能致命 。控製不佳的哮喘患者對日常工作及日常生活都會發生影響 ，可導致誤工 、誤學 ，導致活動 、運動受限 ，使生命質量下降 ，並帶來經濟上的負擔及對家人的生活發生負麵影響 。哮喘反複發作可導致慢性阻塞性肺疾病 、肺氣腫 、肺心病 、心功能衰竭 、呼吸衰竭等並發症。 哮喘發病的危險因素包括宿主因素（遺傳因素）和環境因素兩個方麵 。遺傳因素在很多患者身上都可以體現出來 ，比如絕大多數患者的親人（有血緣關係 、近三代人）當中 ，都可以追溯到有哮喘（反複咳嗽 、喘息）或其他過敏性疾病（過敏性鼻炎 、特應性皮炎）病史 。大多數哮喘患者屬於過敏體質 ，本身可能伴有過敏性鼻炎和/特應性皮炎 ，或者對常見的經空氣傳播的變應原（蟎蟲 、花粉 、寵物 、黴菌等） 、某些食物（堅果、牛奶 、花生 、海鮮類等） 、藥物過敏等 。哮喘的炎症是多種細胞及其釋放的物質參與的慢性過程 ，與氣道高反應性有關 ，但是炎症的劇烈程度與病情的關係尚不明確 。炎症遍布於整個氣管樹 ，在軟骨支氣管尤其明顯 。很多細胞參與炎症的過程 ，但並不存在占主導地位的細胞 ，細胞間的相互作用也不甚清楚 。與炎症有關的炎症介質可能超過100種 ，每一種炎症介質都可能有多重效應 ，因此 ，要搞清楚單個炎症介質在哮喘中所起的作用並不容易 。 現在認為哮喘的反複發作是由於T淋巴細胞及某些結構細胞（如上皮細胞）釋放細胞因子的網絡調控異常導致炎症-上皮損傷-氣道重塑的惡性循環過程（如下圖所示） ；上皮細胞脫落-重建過程能導致氣道上皮下間質結構的改變,上皮細胞產生的Fn是纖維細和上皮細胞本身的趨化因子 ；上皮細胞分泌的有絲分裂原也能刺激纖維細胞的增殖 ，纖維細胞的聚集過程與皮膚疤痕形式相似 ；此外上皮來源的TGF-β還能上調上皮下的纖維細胞產生基質分子 ，包括I型膠原纖維和Fn ，故脫落-重建過程反複發生可導致網狀基底膜增厚 。 已發現 ，支氣管上皮不僅僅是保護組織免受外界侵害的生理屏障 ，在炎症反應中也起重要作用 。上皮細胞受刺激後或自發地合成及分泌許多介質 ，它們能促進粘液分泌 、增加血管滲出 ，使平滑肌收縮 、引起對吸入變應原的速發及遲發性反應 ，是哮喘發病的重要介質 。另外 ，支氣管上皮細胞是複雜的細胞因子及趨化因子的重要來源 。其合成及分泌的細胞因子及趨化因子有白介素-8 、-6 ，粒細胞巨噬細胞集落刺刺激因子（GM-CSF） ，腫瘤壞死因子（TNF-α） 、巨噬細胞炎性蛋白 ，單核細胞趨化肽 ，調節激活正常T細胞表達和分泌細胞因子 。IL-8是重要的中性粒細胞趨化因子 ，與重症哮或哮喘加重有關 ；IL-6的作用不甚清楚 ，它似乎參與T細胞的活化 ，誘導B細胞的終未分化及免疫球蛋白的產生 ；GM-CSF 、RANTES是嗜酸粒細胞趨化因子 ，後者還促使記憶T細胞向氣道遷移 ，也選擇性的吸引CD4+細胞 ，並且也是成熟T細胞的趨化因子 。MIP 、MCP除能趨化單核細胞 、嗜酸粒細胞及嗜堿細胞外 ，還可使CT細胞 、B細胞增殖 。上皮細胞也能表達細胞間粘附分子ICAM-1 ，它在中性粒細胞 、嗜酸粒細胞跨越血管內皮細胞向氣道遷移的過程起重要作用 。許多研究提示哮喘患者上皮細胞中ICAM-1的表達上調 。通過上述細胞因子 、趨化因子及粘附分子 ，上皮細胞可將嗜酸粒細胞 、中性粒細胞等炎性細胞征募到氣道局部 ，炎性細胞進一步分泌炎性介質引起氣道的炎症反應 。所以上皮細胞具有啟動哮喘氣道炎反應並使之持久化的作用 。

研究模型

南宮娛樂已經掌握了原代支氣管上皮細胞的分離培養 ：切除新鮮肺組織 ，去除支氣管外的其他組織 ，保留主支氣管和小的支氣管 ，使用PBS充分衝洗後 ，剪成碎片 ，加入含蛋白酶XIV的消化液中 ，4度過夜消化 ，收集細胞懸液 ，接種在包被膠原的培養瓶中 ，無血清培養基進行原代培養 。1天後細胞逐漸貼壁 ；3-4天後細胞開始逐漸變大 ，呈多邊形（如下圖所示） 。

南宮娛樂建立了冷刺激支氣管上皮細胞的模型（冷空氣刺激是慢性氣道炎症性疾病的一個重要急性加重因素） ：在冷刺激之下 ，支氣管上皮細胞被激活從而誘導鈣離子內流並進一步導致多種細胞因子及趨化因子的產生 ，如下圖所示 。

研究案例 目的 ：研究氧化應激對支氣管上皮細胞CFTR門控功能的影響 結論 ：臭氧應激抑製了支氣管上皮細胞上CFTR的表達及功能 ；臭氧應激後 ，NO 、ROS產生增多 ，參與並激活了STAT1的磷酸化 ，抑製了CFTR的表達 。 路線 ： 1.用臭氧連續應激大鼠3天（每天1小時） ，建立氣道高反應動物模型 。免疫熒光結果顯示 ，臭氧應激的大鼠支氣管上皮頂膜及胞漿中CFTR明顯減少 。

2.應用臭氧攻擊支氣管上皮細胞30分鍾 ，建立氧化應激模型 。qPCR顯示 ，臭氧應激4h後 ，CFTR表達明顯下降 。

3.為研究氧化應激抑製CFTR表達的信號機製 ，在臭氧應激前 ，支氣管上皮細胞被JAK2激酶抑製劑AG490預處理4h ，qPCR發現臭氧刺激後 ，AG490能增加CFTR的表達，AG490單獨處理對CFTR表達沒有影響

4.臭氧處理後 ，STAT1的磷酸化水平隨時間依賴性增加 。通過應用小分子抑製劑預處理細胞 ，顯示AG 、ZnPP-9 、NAC均降低了臭氧誘導的STAT1磷酸化

5.對臭氧應激條件下CFTR的轉錄因子調節譜進行了研究 ：用EMSA觀察到ERa與Sp1的結合活性 ；臭氧應激4h後 ，Sp1/ERa與CFTR的啟動子區的結合活性及核轉位降低 ，抑製CFTR轉錄 。

核心文獻

The airway epithelium in asthma. Nature Medicine 18, 684–692 (2012). https://www.nature.com/nm/journal/v18/n5/full/nm.2737.html Endotyping asthma: new insights into key pathogenic mechanisms in a complex, heterogeneous disease. Lancet 372, 1107–1119 (2008). https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18805339 Divergent functions for airway epithelial matrix metalloproteinase 7 and retinoic acid in experimental asthma. Nat. Immunol. 10, 496–503 (2009). https://www.nature.com/doifinder/10.1038/ni.1719 Defective epithelial barrier function in asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 128, 549–556.e1–12 (2011). https://dx.doi.org/10.1016/j.jaci.2011.05.038 Increased IL-33 expression by epithelial cells in bronchial asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 125, 752–754 (2010). https://dx.doi.org/10.1016/j.jaci.2009.12.935