在II型CRISPR係統中 ，CRISPR RNA（crRNA）與轉錄激活crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退火形成的複合物能特異識別基因組序列 ，引導Cas9核酸內切酶在目的片段生成DNA雙鏈斷裂（double-strand breaks, DSBs） 。 這個識別複合體可以通過融合crRNA與tracrRNA序列形成sgRNA（single-guided RNA）進行簡化 。基因組的靶序列中有長約20bp的片段與crRNA或sgRNA互補配對 ；靶序列末端的三核苷酸區域PAM（5’-NGG-3’）為Cas9識別位點 ，是實現剪切功能的關鍵 。

CRISPR-Cas9體係的RNA-DNA識別機製為基因組工程研究提供了一項簡便而強大的工具 。該體係其中一個最重要的優勢是Cas9蛋白可在多個不同的gRNA的引導下同時靶向多個基因組位點 。