研究背景
自身免疫性疾病
,如係統性紅斑狼瘡(SLE)
、類風濕關節炎(RA)和1型糖尿病等
,是由於機體自身免疫耐受出現異常的結果
。一般情況下
,機體有一係列控製自身反應性T
、B細胞的機製
。克隆消除是免疫係統發展過程第一位的選擇機製
,又稱陰性選擇
。克隆消除是一種中樞耐受
,它可以將對自身抗原產生應答的T細胞進行清除
。但是
,這一機製並不徹底
,一些自身反應性T細胞可以從這一消除機製中逃逸
,從而進人外周係統造成全麵破壞
。為了調節這些可能產生自身損害的T細胞
,機體在外周係統產生了外周耐受
,包括克隆無能
、外周清除
、免疫忽視和一係列調節性T細胞(Treg)
。當機體Treg的數量減少或功能減退時
,便會出現自身免疫性與變態反應性疾病
。如下圖所示
。
Treg種類非常多
,根據細胞表麵CD4分子是否表達可分為CD4+Treg細胞與CD4-Treg細胞
。CD4+Treg在數量上約占人體內外周係統CD4+T細胞的1%-2%
。其他Treg尚處於探索階段
。CD4+Treg可分為自然Treg(nTreg)和適應性Treg(iTreg)
。nTreg是目前研究最多的Treg種群
,最早由Sakaguchi等發現部分CD4+T細胞可高表達IL-2受體的α鏈(CD25)
,並證實具有免疫調節性
。CD25是最早被證實的Treg標誌物
,但它也表達於活化的CD4+T細胞
。一些研究表明CD127(IL-17受體的α鏈)可鑒別人類Treg與活化的CD25+T細胞
,Treg被認為是CD127low
,活化的CD25+T細胞被認為是CD127high
。Foxp3是Treg發育與功能表達過程中的一個重要轉錄因子,也是重要的鑒別標誌物
。
Sakaguchi等最早證明了Treg在自身免疫反應進展中的重要性
。將CD4+中的CD4+CD25+T細胞去除
,在特異性抗CD25抗體輔助下注入無胸腺的小鼠體內
,結果小鼠出現一係列自發的自身免疫疾病
,如甲狀腺炎
、胃炎
、胰島炎、腎小球腎炎
、多關節炎等
。再用CD4+CD25+T細胞注入上述小鼠體內替換CD4+CD25-T細胞
,上述自身免疫性疾病均得到了有效的控製
。Treg發揮調節作用的主要機製有
:(1)分泌抑製性細胞因子
,如IL-10
、TGF-β和IL-35
,並促進其發揮效應。(2)分泌穿孔素與顆粒蛋白酶
。(3)代謝破壞
,Treg通過對生長性細胞因子IL-2的剝奪使效應性T細胞凋亡
。(4)對抗原遞呈細胞增殖和功能的抑製性調節
。
一直以來
,對於人類RA的研究往往傾向於量化外周血中的Treg細胞
,同時在免疫反應中進行定位
。在RA患者中
,滑液中的Treg比外周血中的Treg要高一些
,累積在炎症關節中的Treg高水平表達CTLA-4
、糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(GITR)
、OX-40和Foxp3
。一些關於健康人群與RA患者循環係統中Treg的數量比較研究
,均未得出顯著性結果或呈現互相矛盾結果
。一些研究結果表明RA患者Treg水平下降
,但也有相當一部分研究未發現兩組人群的顯著差異或RA患者Treg水平增高
。盡管RA患者滑液中Treg的增多可以抑製T細胞的增殖與促炎細胞因子(TNF-α
、IFN-γ)的釋放
,但是炎症反應仍然可以繼續發生
。滑液中效應性T細胞與循環係統中效應性T細胞相比
,其對Treg調節作用的敏感性較低
。這些數據與高度活化的CD4+T細胞對Treg調節作用的抵抗現象相符合
。
研究模型
南宮娛樂已經掌握了調節性T細胞的原代分離培養
:製備單個細胞懸液
,以T細胞純化柱分離小鼠淋巴結或脾髒T淋巴細胞
,以抗CD8-FITC抗體和抗FITC標記磁珠相結合的陰性選擇法剔除CD8+T細胞
,再以抗CD25-FITC抗體和抗FITC標記磁珠相結合的陽性選擇法選出CD25+T淋巴細胞
。也可采用CD4+T細胞亞型純化柱分離得到CD4+T細胞
,再結合抗CD25-FITC抗體
,以流式細胞儀分選出純化的CD4+CD25+T細胞
。如下圖所示
。
南宮娛樂建立了調節性T細胞抑製功能檢測模型
:將Treg與CD4+CD25–或CD4+應答性T細胞(Tresp)以不同的比例共培養
,並加入多克隆刺激劑
。單獨的Tresp細胞會有很快的增殖反應(anergy)
。而二者共培養後會導致Tresp細胞的增殖減弱
。抑製實驗可以使用Tresp與Treg細胞的不同比例
,如從1:1到8:1
,作為對照
,可以將Treg和Tresp細胞在加檢測劑和不加檢測劑的情況下單獨培養。如下圖所示
。
研究案例
目的
:探明類風濕關節炎(RA)時調節性T細胞和Th17細胞這兩種亞群在外周血中的分布特征
,進一步分析導致該免疫狀態的分子機製
,明確Notch信號分子在RA外周血T細胞中的表達特性
結論
:RA患者外周血存在Treg/Th17失衡
;Th1和Th17相關的細胞因子增多
,外周血T細胞內Notch信號呈顯著活化狀態
。
路線
:
-
選取活動期及穩定期RA患者
,采取流式細胞術細胞內染色技術檢測外周血中調節性T細胞和Th17細胞百分比
,並應用qPCR檢測這兩種細胞特異的轉錄因子FoxP3和ROR的表達水平
-
RA患者同時檢測調節性T細胞和Th17細胞百分比
,計算Th17/Treg比值
。同時采用流式芯片技術檢測血清中11種細胞因子
,觀察外周血中細胞因子微環境特征
,並分析與Th17/Treg比值的相關性
-
采用流式細胞術檢測RA外周血T細胞Notch受體分子的表達
。應用免疫磁珠分離純化外周血T細胞
,通過qPCR檢測Notch受體及靶基因表達水平
。應用WB檢測T細胞內Notch胞內段核移位
。
核心文獻
-
Interleukin-35 induces regulatory B cells that suppress autoimmune disease.
Nat Med. 2014 Jun;20(6):633-41.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmid/24743305/
-
Good guys gone bad: exTreg cells promote autoimmune arthritis. Nat Med. 2014
Jan;20(1):15-7. https://dx.doi.org/10.1038/nm.3439
-
Pathogenic conversion of Foxp3+ T cells into TH17 cells in autoimmune
arthritis. Nat Med. 2014 Jan;20(1):62-8. https://dx.doi.org/10.1038/nm.3432
-
TNF-α trips up Treg cells in rheumatoid arthritis. Nat Med. 2013
Mar;19(3):269-70. https://dx.doi.org/10.1038/nm.3124
-
Phosphorylation of FOXP3 controls regulatory T cell function and is
inhibited by TNF-α in rheumatoid arthritis. Nat Med. 2013 Mar;19(3):322-8.
https://dx.doi.org/10.1038/nm.3085